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蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS)試劑盒說(shuō)明書微量法

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詳細(xì)介紹

蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS)試劑盒說(shuō)明書

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。SSEC 2.4.1.13)催化植物體內(nèi)游離果糖和葡萄糖合成蔗糖。

測(cè)定原理

SS催化游離果糖與葡萄糖供體UDPG反應(yīng)生成蔗糖,蔗糖與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

試劑的組成和配制

提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

試劑三:液體 2mL×1 瓶,4℃保存

試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;

試劑五:液體 6mL×1 瓶,4℃保存;

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至480nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL)  

測(cè)定管  

對(duì)照管  

標(biāo)準(zhǔn)管  

空白管

樣本  

10

10



蒸餾水  


45  

45  

55

試劑二



10


試劑一

45




混勻,25℃準(zhǔn)確水浴 10min

試劑三  

15  

15  

15  

15

沸水浴中煮沸 10min 左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻

試劑四  

210  

210  

210  

210

試劑五  

60  

60  

60  

60

混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測(cè)定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

SS 活性計(jì)算

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS 活性(μg/min/mg prot)= {C 標(biāo)準(zhǔn)管×V1×測(cè)定管-A 對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×測(cè)定管-A 對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS 活性(μg/min/g 鮮重) = {C 標(biāo)準(zhǔn)管×V1×測(cè)定管-A 對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×測(cè)定管-A 對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W

標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;:反應(yīng)時(shí)間:10min。

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