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過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒說明書微量法

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詳細(xì)介紹

過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

規(guī) 格 :100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 30mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:液體 125μL×1 瓶,4℃保存。

產(chǎn)品說明:

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是最主要的 H2O2 清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能夠分解 H2O2,使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降,根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔(UV 板)、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟:

一、粗酶液提取:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率 20%,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。二、測定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 240nm,蒸餾水調(diào)零。

2、CAT 檢測工作液的配制:用時(shí)在試劑二中加入 25mL 試劑一,充分混勻,作為工作液。

3、測定前將 CAT 檢測工作液在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。

4、準(zhǔn)備96孔UV 板一塊(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測波長小于 340nm務(wù)必使用UV 板)。

5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 工作液,立即混勻并計(jì)時(shí),記錄 240nm

下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。三、CAT 活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)CAT 活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=459×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=459×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T=459×ΔA÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣÷V 樣總×500)÷T =0.917×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:H2O2 摩爾消光系數(shù),4.36×104L/ mol /cm;d:比色皿光徑,

1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W: 樣本鮮重,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬;109:單位換算系數(shù), 1 mol=109nmol。

b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)CAT 活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=764.5×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T=764.5×ΔA÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣÷V 樣總×500)÷T=1.529×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:H2O2 摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol/ cm;d:96 孔板光徑,

0.6cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W: 樣本鮮重,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬;109:單位換算系數(shù), 1 mol=109nmol。



注意事項(xiàng):

出現(xiàn)負(fù)值怎么辦? 首先檢查吸光值是否超過 3,如果超過3很可能是沒有用UV 板,請(qǐng)換用 UV 板。如果未超過 3,仍然出現(xiàn)負(fù)值則檢查反應(yīng)過程是否產(chǎn)生氣泡,氣泡多說明酶活性太高,氣泡影響 產(chǎn)生了負(fù)值,可以將樣本用提取液稀釋 10 倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒有產(chǎn)生 氣泡仍然出現(xiàn)較小的負(fù)值,說明該樣本測不到該酶活。


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