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HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書
點擊次數(shù):1735 更新時間:2020-02-24

  

 

 

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書

 

 

 

HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒

目錄號:K0745

保存條件:-20℃保存。

 

組分說明

Cat. No.                    K0745           

Kit Size                    100

HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix  50 μl

2×OneStep RT-PCR Buffer         1.4 ml

RNase-Free Water               1 ml

 

 

            本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

 

 

產(chǎn)品簡介

 

  本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進行,

反應(yīng)過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗

效率。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動   DNA聚合酶,同時包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和

PCR擴增的反應(yīng)緩沖液和實驗中所必需的反應(yīng)組分。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性

缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性強,可獲得高產(chǎn)

量的cDNA。PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動DNA聚合酶具有擴增效率高、延伸速度快的優(yōu)

良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴增得

到的目的產(chǎn)物3′端附有一個″A″堿基,可直接用于T/A克隆。

 

注意事項

 

1.在操作過程中應(yīng)避免RNase污染,防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?,建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2.實驗盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應(yīng)使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙

   酯)水溶液在37℃處理12小時,并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用,或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3.本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃,避免反復(fù)凍融。

4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實驗來選擇,引物設(shè)計的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應(yīng)的結(jié)果,設(shè)計引物時需考慮GC含量,引物長度,引物

   位置,PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專業(yè)的引物設(shè)計軟件來設(shè)計。

 

使用方法

 

1.將RNA模板、引物、  OneStep RT-PCR  Buffer、OneStep  RT-PCR  EnzymeMix

   和RNase-Free  Water溶解并置于冰上備用。

2.根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系:

 

 試劑        25 μl反應(yīng)體系         終濃度

2×One Step RT-PCR Buffer     12.5 μl     1×

Forward Primer,10 µM       1 μl     0.4 μM

Reverse Primer,10 µM       1 μl         0.4 μM

HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix     0.5 μl

RNA Template           X μl    10 pg –1 µg

RNase-Free water      up to 25 μl

 

   注意:引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

 

3.渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。

4.將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃,將PCR管置于熱循環(huán)儀中,進行RT-PCR反應(yīng)。

   反應(yīng)條件:

 

步驟      溫度     時間

反轉(zhuǎn)錄    45℃      30 min

PCR預(yù)變性  95℃       2 min

變性    94℃       30 s

退火   55-65℃      30 s    30-40個循環(huán)

延伸   72℃       30 s

終延伸  72℃       5 min

 

   注意:1)一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為20-30秒,無法得到理想的擴增效率時,適當(dāng)降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

   2)延伸時間根據(jù)擴增的片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。

   3)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

 

5.反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結(jié)果。

 

     相關(guān)產(chǎn)品信息

 

目錄號               產(chǎn)品名稱                                   產(chǎn)品特點

YJ0580   TRIzon總RNA提取試劑               適用范圍廣的RNA提取試劑

YJ0581 超純RNA提取試劑盒

兼具有適用范圍廣和純度高特點的RNA提取試劑

K0597 超純RNA提取試劑盒(含DnaseI)    靈敏度高,可識別pg級別的模板。與RNA親和力強,

K0741   SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒能夠通讀GC含量高,二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。

K0744   HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA第--鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄(針對于熒光定量PCR劑盒(For Real-time PCR))

K2381                       僅需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

SuperQuickRT MasterMix  即用型逆轉(zhuǎn)錄mix,只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅

K2391 (for Real-Time PCR)   需15分鐘,即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

K0688   Es Taq DNA Polymerase 兼具高擴增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

K0690   Es Taq MasterMix

K0957   UltraSYBR Mixture         熒光定量PCR—SYBR Green法

K0956   UltraSYBR Mixture(With ROX)   特異性強、Ct值低、定量更準確

 

 

        

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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