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神經(jīng)HRP示蹤顯色液(TMB法)說(shuō)明書(shū)
點(diǎn)擊次數(shù):3424 更新時(shí)間:2019-02-13

 經(jīng)HRP示蹤色液(TMB法)說(shuō)明書(shū)

 

上個(gè)世紀(jì) 70 年代,Kristensopn Olsson 報(bào)道了HRP可神經(jīng)末梢,經(jīng)軸漿逆行運(yùn)至神經(jīng)元胞體,經(jīng)組織化學(xué)方法可示出神經(jīng)元的廓,從而開(kāi)發(fā)HRP  追蹤神經(jīng)示蹤技術(shù),即HRP 法。3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的試驗(yàn)顯,能

溶解于多有機(jī)溶和雙蒸水中,為穩(wěn)定的無(wú)色溶液,不適量過(guò)氧化或雙氧水不沖液混   勻后,不過(guò)氧化物作用產(chǎn)生清晰的藍(lán)產(chǎn)物,極易察,在辣根過(guò)氧化物的催化下 , TMB 會(huì)產(chǎn)藍(lán)色沉淀,沉淀溶于水和乙醇,色后呈藍(lán)色,可在察。

經(jīng) HRP 示蹤色液(TMB )動(dòng)經(jīng)麻醉、注入HRP后,游離或絡(luò)合型HRP 不氧化應(yīng)生成絡(luò)合物,該絡(luò)合物氧化供TMB ,呈藍(lán)色,在下清晰可見(jiàn),該檢測(cè)DAB  法靈敏。該顯色液用于科研領(lǐng)域,宜用于斷或其他用途。

 

 

產(chǎn)

 

 

 

 

50T

試劑(A): TMB assay buffer

2×500ml

RT 避 光

試劑(B): TMB  色液

30ml

-20℃ 避 光

試劑(C): TMB  強(qiáng)劑

2×1ml

RT

試劑(D): TMB Wash buffer(20×)

100ml

RT

操作步驟(供參考)

 (一)、準(zhǔn)工作

1、動(dòng)物麻醉:多用(3.5%)戊巴比麻醉,大鼠的麻醉0.25-0.35ml/100g。

2導(dǎo)HRP:有力注射法、泳法以及周經(jīng)統(tǒng)的注射涂抹等法。

3、確定動(dòng)物存活期。

4、動(dòng)物灌注:麻醉后,經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管行心內(nèi)灌注固定。先用生理水或 PBS 快速灌注。隨后用 4%的多聚甲固定液灌注,先快后慢,時(shí)間控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸沖液(pH7.4)

5、材:組織置于 20%的蔗糖磷酸鹽緩沖液中,切片厚度 40μm,存于蔗糖磷酸鹽緩用。

(二)、色反應(yīng)

1、配制TMB孵育液:適量的TMB assay buffer TMB色液,按 TMB assay bufferTMB色液=39:1 的比例混合,即TMB孵育液,即配即用,宜保存。

2、配制TMB色工作液:適量的TMB孵育液和TMB強(qiáng)劑,按TMB孵育液:TMB 強(qiáng)劑=200080001 的比例混合(具體比例應(yīng)根據(jù)具體時(shí)間摸索確定),即TMB工作液,即配即用,宜保存。

3、配制 1×TMB Wash buffer適量的TMB Wash buffer(20×),按TMB Wash buffer: 蒸=1:19 的比例混合,即1×TMB Wash buffer。室溫保存6個(gè)月有效。

4、切片用蒸水清洗 3 次,2min。

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃溫育),避光孵育20min,其斷晃動(dòng)

6、切片入10ml TMB 色工作液(提前 20℃溫育),避光孵育 20min,其斷晃動(dòng)7、漂洗:10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次,5min。

8片,玻片用明膠包被,室溫空氣干燥。

9、脫水、透明步驟按如下操作:

10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次,10s

二甲苯2次,25min。

  1. 中性樹(shù)膠封片,藍(lán)色反應(yīng)

 

 注意事項(xiàng)

1、如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀,表明TMB底物反應(yīng)過(guò)強(qiáng)烈。

2、所用器皿必須潔凈,避免含有氧化,否會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。

3、TMB色液避免反復(fù)凍融,以免色效率下降。

4、TMB強(qiáng)劑注意密保存,否則顯色效率下降。

有效期: 12 個(gè)月內(nèi)有效。   

 

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